Flüssigchromatographie (LC)

Die Flüssigchromatographie (LC) wird zur Trennung von Substanz-Gemischen in Lösung verwendet. Die Substanzen können anschließend mit empfindlichen Techniken wie Massenspektrometrie und UV-Spektrophotometrie nachgewiesen werden. Die am häufigsten verwendeten LC-Methoden sind Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Ionenchromatographie (IC).
Flüssigkeitschromatographie

Die Flüssigchromatographie ist eines der leistungsfähigsten Instrumente im Analytik-Labor. Sie wird sehr häufig zur Trennung und Analyse aller Arten von gemischten Verbindungen eingesetzt. Die Kombination mit der Empfindlichkeit und Selektivität der Massenspektrometrie steigert ihre Leistungsfähigkeit erheblich.

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Wie funktionieren Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Ionenchromatographie (IC) und

Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung (LC-MS)?

Bei der Flüssigchromatographie fließt eine Flüssigkeit (die mobile Phase/das Elutionsmittel) unter hohem Druck durch ein inertes Rohr (Trennsäule), die mit einer stationären Phase gefüllt ist. Eine Probe wird vor der Säule in das Elutionsmittel eingespritzt. Auf ihrem Weg durch die Säule benötigt jede Verbindung der Probe aufgrund ihrer Wechselwirkung mit dem Elutionsmittel und der stationären Phase eine bestimmte Zeit, um das Ende der Säule zu erreichen. Dies hängt von den Eigenschaften der Verbindung ab und kann zur Trennung von Mischungen sehr ähnlicher Verbindungen verwendet werden. Nach der Trennung können die Verbindungen beim Austritt aus der Säule mit einer Reihe von Detektoren gemessen werden - sowohl nicht-selektiven als auch selektiven.

Verschiedene Säulenmaterialien unterstützen unterschiedliche Trennmechanismen - Normalphasen-, Umkehrphasen-, Größenausschluss-, Ionenaustausch-, Affinitäts-, chirale oder hydrophile Interaktions-HPLC. Bei der Normalphasen-HPLC wird eine polare stationäre Phase und ein weniger polares oder unpolares Elutionsmittel verwendet. Bei der Reversed-Phase-LC werden diese Polaritäten umgedreht.

 

Wie funktioniert die Ionenchromatographie (IC)?

Die Ionenchromatographie (IC) ist eine Variante der HPLC, bei der die Wechselwirkung der stationären Phase auf dem Ionenaustausch beruht. Sie wird daher zur Trennung von Ionen oder geladenen Spezies eingesetzt. Anionen und Kationen werden auf separaten Säulen getrennt. Im Gegensatz zur HPLC, bei der der Schwerpunkt auf der Trennung ähnlicher Verbindungen liegt, sind die Trennungen bei der IC eher standardisiert und der Schwerpunkt liegt auf Genauigkeit und Empfindlichkeit. Aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften von Ionen werden häufig Leitfähigkeitsdetektoren verwendet. Um die Empfindlichkeit zu verbessern, wird die Hintergrundleitfähigkeit des Eluenten vor der Detektion der Ionen entfernt. Um eine wesentlich höhere Empfindlichkeit zu erreichen, können die Ionen auf einer kurzen Ionenaustauschersäule vorkonzentriert und dann zur Trennung in den Eluentenstrom eluiert werden. Auf diese Weise lassen sich viele Anionen im Spurenbereich sehr effektiv bestimmen. Die IC wird häufig zur Ergänzung der ICP-MS-Bestimmung von Metallen in einer Probe eingesetzt. 

 

Wozu dient die Flüssigchromatographie (LC)?

Die Flüssigchromatographie ist die bei weitem am häufigsten verwendete Technik zur Bestimmung eines oder mehrerer Bestandteile in einem Gemisch. Durch geeignete Wahl des Eluenten und der stationären Phase können alle Arten von Verbindungen in Lösung getrennt werden. Die HPLC wird für die Hochdrucktrennung von Gemischen organischer Verbindungen verwendet. Die IC ermöglicht die Bestimmung von Anionen und Kationen und anderen geladenen Spezies. Die LC-MS hat den Vorteil, dass sie eine selektive Detektion der Komponenten ermöglicht, so dass eine vollständige chromatographische Trennung der Komponenten nicht erforderlich ist. Sie kann auch zusätzliche Struktur- und Molekulargewichtsinformationen zur Unterstützung der Identifizierung liefern.

 

Wann sollten Sie die Flüssigchromatographie (LC) einsetzen?

 

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC):

Die HPLC ist die Technik der Wahl, wenn es darum geht, Materialien auf ein möglichst breites Spektrum an organischen Verbindungen zu analysieren. Flüchtige Verbindungen (VOC und SVOC) lassen sich in der Regel am besten mit GC oder GC-MS analysieren, aber die HPLC eignet sich für eine viel größere Vielfalt von Gemischen, einschließlich nicht flüchtiger oder thermisch instabiler Moleküle. Zu ihren Vorteilen gehören Vielseitigkeit, Empfindlichkeit und Anwendbarkeit auf sehr komplexe Gemische. 

Ionenchromatographie (IC):

Die IC ist eine Variante der HPLC, bei der die stationäre Phase ein Ionenaustauscherharz ist. Dies ermöglicht die Trennung von ionischen und geladenen Komponenten und wird häufig zur Bestimmung von Kationen und insbesondere Anionen in wässrigen Proben verwendet. Sie ist leicht zu quantifizieren und kann mit Vorkonzentrationstechniken eine sehr hohe Empfindlichkeit erreichen.

Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung (LC-MS):

LC-MS bietet eine hohe Empfindlichkeit und Selektivität. Sie ist die Technik der Wahl für die Analyse komplexer Mischungen von Verbindungen - sowohl für die Identifizierung unbekannter Stoffe als auch für die Gewinnung quantitativer Daten über Spuren- und Minderbestandteile. Die Kombination von LC und MS liefert eine Vielzahl von Informationen, die bei der Identifizierung von Verbindungen hilfreich sind.

 

Arten der Flüssigchromatographie (LC)

Die Vielseitigkeit der Flüssigchromatographie hat zu einer breiten Palette von Instrumenten für unterschiedliche Anwendungen geführt. Praktisch alle LC-Verfahren werden unter sehr hohem Druck durchgeführt. Dieser ist erforderlich ist, um die mobile Phase durch die feinen Kügelchen in der gepackten Trennsäule zu pumpen. Die UHPLC verwendet feinere Kügelchen und arbeitet mit noch höherem Druck.

Es gibt eine große Auswahl an verschiedenen Detektoren - MS ist der leistungsstärkste und flexibelste. Viele MS-Detektoren sind Quadrupolgeräte mit geringer Auflösung, hochauflösende Massenspektrometer ermöglichen jedoch eindeutige Identifizierungen. Zu den weit verbreiteten Detektoren gehören Spektralphotometer für die meisten hochempfindlichen Anwendungen und elektrische Leitfähigkeit für IC.

Der Einfluss von Wasser

Welchen Einfluss hat die Wasserreinheit bei HPLC, IC und LC-MS?

Wasser ist das Reagenz, das in der Flüssigchromatographie in den größten Mengen verwendet wird. Seine Reinheit ist von entscheidender Bedeutung, insbesondere bei hochempfindlichen Anwendungen. Hier wird Wasser für die Probenvorbehandlung, z.B. die Festphasenextraktion und für die Herstellung von Eluenten, Reagenzienblindwert und Standards benötigt. Im Wasser enthaltene Verunreinigungen können das Hintergrundrauschen und die Drift erhöhen sowie Geister-Peaks oder Peak-Tailing erzeugen, was sich möglicherweise gravierend auf die Empfindlichkeit und Selektivität auswirkt. Moderne Software mit automatischer Auswahl von Peaks und Hintergrundwerten reagiert besonders empfindlich auf unerwartete Änderungen des Hintergrunds aufgrund von Verunreinigungen. Eine langfristige Ansammlung von Verunreinigungen im System kann eine Drift verursachen und die Komponenten beeinträchtigen.

Welche Arten von Verunreinigungen im Wasser können die Ergebnisse der Flüssigchromatographie (LC) beeinflussen?

Die wichtigsten Verunreinigungen im Wasser, die HPLC und LC-MS beeinflussen, sind organische Verbindungen und in geringerem Maße Ionen, Bakterien und Partikel. Die IC ist besonders empfindlich gegenüber ionischen Spurenverunreinigungen.

1. Organische Verbindungen

In der LC können organische Verbindungen im verwendeten Wasser eine Reihe von chromatographischen Problemen verursachen. Sie konkurrieren mit dem Analyten um die aktiven Stellen der stationären Phase, blockieren aktive Stellen und bilden Geisterpeaks. Sie können auch in der LC-MS stören, indem sie Ionen mit Massen erzeugen, die den zu analysierenden Elementen ähneln, und indem sie die Ionisierungseffizienz beeinträchtigen.

2. Ionen

Ionen in Wasser, das für die IC verwendet wird, verstärken das Hintergrundrauschen und die Drift und erzeugen Geister-Peaks. Damit können sie die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit beeinträchtigen. In der LC-MS können Metallionen Addukte bilden, die die Interpretation des Massenspektrums erschweren.

3. Bakterien und Partikel

Partikel und Bakterien können mit der Zeit die Säule und andere Komponenten blockieren. Bakterien können auch organische Nebenprodukte erzeugen, die die Chromatographie beeinträchtigen können.

Welche Anforderungen werden an die Wasserreinheit für HPLC, IC und LC-MS gestellt?

Die erforderliche Wasserreinheit hängt von der Empfindlichkeit der Anwendungen ab. Für allgemeine Analysen ist Reinwasser des Typs II ausreichend, aber für empfindliche Arbeiten sind sehr niedrige Verunreinigen wichtig. TOC-Werte unter 2 ppb sind für die empfindlichsten Anwendungen sehr wünschenswert.

MethodeSensibilität der AnwendungWiderstand 
(MΩ*cm) bei 25°C
TOC 
(ppb)
Filter 
(µm)
Bakterien (KBE/ml)Endotoxine (EU/ml)NukleasenLaborwasser-Typ
HPLCAllgemein>5<20<0,2<10k.A.k.A.Typ II+ Reinwasser
HPLCHoch>18<2<0,2<1<0,03k.A.Typ I+ Reinstwasser
ICAllgemein>5<50<0,2<10k.A.k.A.Typ II+ Reinwasser
ICHoch18,2<10<0,2<1<0,03k.A.Typ I+ Reinstwasser
LC-MSHoch>18<2<0,2<1<0,03k.A.Typ I+ Reinstwasser

Wie löst ELGA Probleme mit der Wasserreinheit in der Flüssigchromatographie (LC)?

Dank seiner Expertise kann das ELGA-Team Kunden bei der Auswahl der korrekten Wasserreinheit für ihre Anwendungen helfen. Wir liefern eine Reihe von Laborwassersystemen, die nachweislich die Anforderungen für HPLC, IC und LC-MS erfüllen. Unser Reinstwassersystem PURELAB Chorus 1 Analytical Research liefert beispielsweise Reinstwasser mit 18,2 MΩ*cm (Typ I/I+) und einem sehr niedrigen TOC-Gehalt von 1-3 ppb, das für alle LC-Anwendungen geeignet ist. Die anorganische Reinheit ist ein Schlüsselfaktor für Wasser, das in der IC verwendet wird, und unsere fortschrittliche PureSure-Technologie garantiert die Rückhaltung von Ionen-Kontaminationen. Eine Überwachung des TOC-Wertes ist ebenfalls integriert. 

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Zusammenfassung

Aufgrund der sehr hohen Empfindlichkeit von Flüssigchromatographie-Techniken muss unbedingt sichergestellt werden, dass das zur Herstellung von Eluenten, Blindproben, Proben und Standards verwendete Wasser keine Verunreinigungen enthält. Eine TOC-Überwachung gewährleistet die Wasserqualität in Bezug auf organische Verunreinigungen. Die Verwendung von Reinstwasser der Typen I oder I+ ist entscheidend. Die ELGA PureSure-Technologie ist ein besonders effektiver Weg, um die Eliminierung von ionischen Verunreinigungen sicherzustellen. Für weniger kritische Anwendungen ist ein System zur Produktion von Typ II+ Reinwasser sehr gut geeignet.
 

 

 

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