Flüssigchromatographie

Die Flüssigkeitschromatographie mit Anwendungen wie HPLC oder Ionenchromatographie ist ein Trennverfahren. Sie dient dazu, einzelne Komponenten eines Gemisches zu identifizieren, zu quantifizieren und zu reinigen.
Flüssigkeitschromatographie

Die Flüssigchromatographie (LC = Liquid Chromatographie) ist eines der leistungsfähigsten Werkzeuge in der analytischen Chemie und eines der am häufigsten verwendeten Instrumente im Labor. Bei dieser Technik ist die mobile Phase eine Flüssigkeit.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)

Die Hochdruckflüssigchromatographie, heute bekannt als Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), ist eine chromatographische Technik. Sie wird eingesetzt um einzelne Komponenten eines Gemisches zu identifizieren, zu quantifizieren, zu trennen und zu reinigen [1].

Wie funktioniert Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)?

Bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) wird die Probe mithilfe einer Flüssigkeit - der "mobilen Phase" - unter hohem Druck durch eine Säule gepresst, die mit einem festen, adsorbierendem Material - der "stationären Phase" - gefüllt ist. Der Druck im System wird mithilfe von Pumpen aufgebaut. Das Funktionsprinzip basiert darauf, dass jede Komponente in dem zu analysierenden Gemisch jeweils unterschiedlich mit dem adsorbierenden Füllmaterial in der Säule interagiert. Dies resultiert in unterschiedlichen Fließraten für die verschiedenen Komponenten und führt zu einer Trennung der Komponenten, wenn sie die Säule verlassen. Das in der stationären Phase eingesetzte adsorbierende Material ist typischerweise körnig und besteht aus festen Partikeln wie Silikat. Die unter Druck stehende mobile Phase ist eine Mischung aus Lösungsmitteln, z.B. Wasser und organische Flüssigkeiten wie Methanol und Acetonitril.

Der Detektor ist mit einem digitalen Mikroprozessor verbunden und nutzt Software zu Messung und Analyse der Daten. Die voneinander getrennten Komponenten werden als Spitzen, den sogenannten "Peaks", dargestellt. Die Anzahl der Peaks entspricht der Anzahl der voneinander getrennten Komponenten aus dem Gemisch. Die Fläche des Peaks verhält sich proportional zu der Konzentration der Komponente im Gemisch [2]. Die Auflösung - also der Abstand zwischen zwei Peaks - entspricht bei chromatographischen Techniken dem Ausmaß der Trennung der Substanzen im Versuch. Eine höhere Auflösung steht für eine gute Trennung der Komponenten.

Wo wird Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) eingesetzt?

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) wird für zahlreiche Anwendungen eingesetzt, unter anderem in der Biochemie, der analytischen Chemie, bei der Entwicklung von Arzneimitteln, in der Forensik oder der Nahrungsmittel-Forschung. Auch beim Nachweis verbotener Substanzen für Sportler kommt HPLC zum Einsatz (englischen Artikel lesen). 

Warum wird die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) genutzt?

HPLC ist erschwinglich und anpassungsfähig. Sie liefert praktische Vorteile wie Datenmanagement und Instrumentenvalidierung.

Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC)

Die Ultra-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPLC) ist eine Variante der HPLC, die kleinere Partikel zur Verbesserung der chromatographischen Leistung verwendet und höhere Drücke erfordert. Ähnlich wie bei der HPLC können sich Verunreinigungen im Wasser negativ auf die Ergebnisse auswirken, was jedoch aufgrund der höheren Empfindlichkeit der UHPLC extremere Folgen haben kann.

Ionenchromatographie (IC)

Die Ionenchromatographie ermöglicht die Trennung von Ionen und polaren Molekülen aufgrund ihrer Wechselwirkung mit einer Säule von Ionenaustauschermedien. Sie kann für fast alle Arten von geladenen Molekülen verwendet werden, darunter große Proteine, kleine Nukleotide und Aminosäuren. Sie wird sehr häufig zur Bestimmung von anorganischen und organischen Kationen und Anionen eingesetzt.

Der Einfluss von Laborwasser

Die Qualität des Laborwasser beeinflusst nahezu jeden Aspekt der HPLC-Analyse - angefangen bei der Vorbereitung von Probe und Standard bis hin zum Spülen und Auswaschen der Säule. Wasser ist damit das am häufigsten genutzte Reagenz in der HPLC. 

Typischerweise wird Reinwasser (Typ II) zur Vorbereitung von Blindproben, Standards und Eluenten sowie zur Probenvorbehandlung verwendet. Da Gradienten-HPLC jedoch in der Lage ist, extrem niedrige Nachweisgrenzen zu erreichen, sind die Anforderungen an Wasser hier strenger und es wird höchste Qualität gefordert.

Ein hoher Anteil an Performance-Problemen in der HPLC werden durch eine unzureichende Qualität des Laborwassers verursacht, das zur Vorbereitung von HPLC-Eluenten, -Standards und -Proben eingesetzt wird. Eine zu niedrige Laborwasser-Qualität oder verunreinigtes Laborwasser beeinflussen die Auflösung, in dem sie Geister-Peaks verursachen, die Selektivität der stationären Phase verändern und Basislinien während der chromatographischen Trennung beeinträchtigen.

Außerdem kann es zu einer zunehmenden Ansammlung von Verunreinigungen in der stationären Phase kommen, welche die Säule blockieren können. Das führt zu einer Erhöhung des Drucks und zu einer Verschiebung der Probenlaufzeit. Eine schlechte Daten-Qualität wie schwankende Retentionszeiten, Auflösungsverlust und Geister-Peaks können ein Hinweis auf eine Kontamination des verwendeten Laborwassers durch organische Stoffe, Ionen, Bakterien oder Partikel sein.

Welche Verunreinigungen im Laborwasser können HPLC-Ergebnisse beeinflussen?


1. Organische Stoffe

Organische Verunreinigungen im Laborwasser können die chromatographische Trennung auf verschiedene Arten beeinflussen:

(a) Verringerung der Lebensdauer der Säule - Organische Moleküle, die sich an der Oberfläche der Säule anlagern, können den Zugang von Proben- und Lösungsmolekülen zu den Bindungsstellen in der stationären Phase verlangsamen. Das führt zu einer verringerten Trennfähigkeit der Säule oder einem Auflösungsverlust sowie zu einer verkürzten Säulen-Lebensdauer.

(b) Verringerte Empfindlichkeit - Organische Moleküle im Eluenten-Wasser können mit den Molekülen aus der Probe um Bindungsstellen in der stationären Phase konkurrieren. Dies reduziert die Anzahl der Moleküle, die sich an die Säule binden, und damit auch die Anzahl der Moleküle, die im Elutions-Prozess abgeschieden werden.

(c) Fehlerhafte Daten - Verunreinigungs- bzw. Geister-Peaks können durch organische Stoffe entstehen, die sich am Kopf der Säule ansammeln und später als Eluate aufgefangen werden.

(d) Schwankende Retentionszeit - Hohe Gehalte an organischen Stoffen können in der Säule eine neue stationäre Phase bilden und damit eine Verschiebung der Retentionszeit und Peak-Tailing verursachen. Sie können auch zu einer Erhöhung des Gegendrucks führen.

Aus diesen Gründen ist es unerlässlich, den Gehalt an organischen Stoffen in Laborwasser für HPLC-Anwendungen genau zu überwachen. Der TOC-Gehalt ist ein Messwert für den Gesamtanteil an organischem Kohlenstoff in Wasser. Der TOC-Gehalt wird in den Einheiten ppm (ein Millionstel) oder ppb (ein Milliardstel) angegeben. Organische Stoffe in hohen ppb-Gehalten können die spektrale Identifikation von Spurenstoffen innerhalb des Gemisches verändern und die Quantifizierung von Peaks beeinflussen.

Ein HPLC-System kann durch zahlreiche TOC-Quellen kontaminiert werden. Dazu zählen Wasser sowie Auswaschungen aus Aufbereituns-Medien, Schläuchen und Behältern, bakterielle Verunreinigungen und potentiell auch die Aufnahme aus der Atmosphäre. Mittlerweile wird empfohlen, nicht frisch aufbereitetes Reinstwasser aus Flaschen nicht zu nutzen. Diese Empfehlung beruht darauf, dass HPLC-Flaschenwasser oder destilliertes Wasser, das länger als 8 Stunden im Labor steht und organischen Stoffen aus der Atmosphäre ausgesetzt ist, anfällig für einen Anstieg des TOC-Gehalt ist.

Die Grafik 1 vergleicht das Chromatogramm von HPLC-Flaschenwasser mit dem von Reinstwasser, gemessen bei Wellenängen von 254nm und 214 nm. HPLC-Flaschenwasser zeigt im Vergleich zu Reinstwasser höhere TOC-Gehalte, die aus der Säule austreten und driftende Basislinien mit einer erhöhten Größe und Anzahl von Peaks verursachen können.

Die Verwendung von frisch aufbereitetem Reinstwasser ist deshalb in der HPLC unerlässlich und es ist wichtig, dieses Wasser vor einer erneuten Kontamination durch verschiedenste Verunreinigungen zu schützen. HPLC-Anwender sollten also zusätzlich zur Reinheit von organischen Lösungsmitteln, Standards und weiterer Bestandteile der mobilen Phase auch eine hohe Qualität und Reinheit des verwendeten Reagenzwassers sicherstellen.

2. Partikel und Kolloide

Partikel und Kolloide im Wasser können die Pumpe und den Injektor beschädigen und die Säule verstopfen. Sie können sich in der Säule wie eine stationäre Phase verhalten und sich an die Probenbestandteile binden. Kolloide können auch irreversibel im Füllmaterial der Säule adsorbiert werden und damit verhindern, dass sich die Probenbestandteile an die Säule binden.

3. Ionen

Ionen im Lösungsmittel können die chromatographische Trennung ebenfalls beeinträchtigen. Alle UV-absorbierende Ionen wie Nitrate, Nitrite, Sulfate, Bromide, Chloride und Fluoride können durch die Säule wandern, im Chromatogramm als Peak auftauchen und damit die Analyse der Daten erschweren.

Unter den verschiedenen Wasser-Verunreinigungen, die HPLC-Analysen beeinflussen können, sind organische Stoffe bei weitem die wichtigsten Faktoren für die Wasser-Reinheit. Experimentelle Beweise legen eindeutig nahe, dass frisch aufbereitetes Reinstwasser für HPLC-Anwendungen genutzt werden sollte. Andere Laborwasser-Arten wie destilliertes oder HPLC-Flaschenwasser können immer noch recht hohe Anteile an organischen Stoffen enthalten, welche die Qualität des Chromatogramms und die Leistung des Apparats gefährden können.

Aus diesen Gründen ist der Einsatz und die fachgerechte Wartung eines hochwertigen Reinstwassersystems unbedingt zu empfehlen.  

Die richtige Wasser-Qualität

Stellen Sie sicher, dass Sie die für Ihre Anwendung angemessene Wasserqualität verwenden. Hier sind die Anforderungen für Flüssigkeitschromatographie-Anwendungen

 Erforderte Sensibilität der AnwendungWiderstand 
(MΩ cm) bei 25°C
TOC 
(ppb)
Filter 
(µm)
Bakterien (KBE/ml)Endotoxine (EU/ml)Nukleasen

Erforderliche
Laborwasser-Qualität

Ionenchromatographie

Allgemein

Hoch

>5

18,2

<50

<10

<0,2

<0,2

<10

<1

NZ

NZ

NZ

NZ

Typ II Reinwasser

Typ I+ Reinstwasser

HPLC

Allgemein

Hoch

>1

>18

<50

<3

<0,2

<0,2

<1

<1

NZ

NZ

NZ

NZ

Typ II Reinwasser

Typ I 
Reinstwasser

 

Wie löst ELGA Veolia Wasserprobleme in der HPLC?

Es gibt eine Reihe von Reinstwassersystemen, die unterschiedliche Verfahren nutzen und jeweils unterschiedliche Vorteile bieten. ELGA ist seit Jahrzehnten als Experte für Rein- und Reinstwassersysteme bekannt. Wir unterscheiden Laborwasser in verschiedene Reinheitsgrade, die Ihnen dabei helfen, die richtige Laborwasserqualität für Ihre jeweilige Anwendung zu ermitteln. Unser Reinstwassersystem PURELAB Chorus 1 Analytical Research liefert beispielweise Typ 1 Reinstwasser mit einem sehr niedrigen TOC-Gehalt von 1-3 ppb, das für HPLC-Experimente besonders gut geeignet ist. Unsere Laborwasseranlagen sind einfach zu bedienen, kosteneffizient und wartungsarm.

Zusammenfassung

Die Reinheit von Wasser, das als Laborreagenz genutzt wird, ist entscheidend für den Erfolg von Versuchen. Hochsensible Technologien wie HPLC erfordern Wasser von sehr hoher Reinheit. Das verwendete Wasser sollte minimale TOC-Gehalte aufweisen und frei von anderen Verunreinigungen sein. Frisch aufbereitetes Reinstwasser ist die optimale Wahl für HPLC Analysen. Die breite Palette an ELGA Rein- und Reinstwassersystemen hilft Wissenschaftlern weltweit, die in ihren Experimenten jeweils erforderliche Wasserreinheit zu erzeugen. 

Referenzen:

[1] Jena A Kumar. HPLC: Highly Accessible Instrument in Pharmaceutical Industry for Effective Method Development. Pharm Anal Acta 2012;3. doi:10.4172/2153-2435.1000147.

[2] Malviya R, Bansal V, Prakash Pal O, Kumar Sharma P. High performance liquid chromatography: A short review. J Glob Pharma Technol 2010;2:22–6.
 

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